现在越来越多的人关注通过膳食行为干预预防溃疡性结肠炎（UC），研究表明，包括乳制品和浆果在内的多种食物可以通过增强肠上皮屏障的完整性、抑制炎症细胞因子和使功能失调的肠道炎症正常化来帮助预防UC。驴乳含有大量的乳糖、蛋白质、矿物质、ω-3脂肪酸和其他的营养成分，其中蛋白质提供能量和各种生理功能，包括抗菌、抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。并且已经证明驴乳中存在各种丰富的功能成分可以诱导抗炎细胞因子并维持免疫稳态。然而，驴乳中主要功能成分之一驴乳清蛋白（DWP）对UC的治疗作用及其潜在机制仍有待探索。
本研究旨在使用蛋白质组学方法表征DWP的成分，随后探讨其对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠的治疗作用及其潜在机制。这项研究工作将有助于更深入地了解DWP的具体组成和功能，并为驴乳功能产品的开发和利用提供理论依据。
采用基于MS的蛋白质组学方法探究驴乳和牛乳中的乳清蛋白，结果表明驴乳和牛乳鉴定出1900种乳清蛋白。其中，DWP和BWP组中均鉴定出623种蛋白质，而牛乳和驴乳分别鉴定出911种和366种蛋白质。此外，在驴乳和牛乳之间鉴定出229个差异表达乳清蛋白（DEWPs），其中驴乳中163个DEWPs下调，66个DEWPs上调。
图1A和1E分别是DWP特异性蛋白的GO和KEGG结果，表明DWP特异性蛋白富集的通路有炎症调节、抗原加工和呈递、信号转导子活性等。此外，BWP特异性蛋白富集于补体经典途径的激活、I-κB激酶/NF-κB信号的正调控、补体和凝血级联途径等通路（图1B、1F）。DWPs中上调蛋白的GO和KEGG结果（图1C、1G）表明，DWPs中上调蛋白富集在趋化活性、氧化还原酶活性、作用于CH-OH基团供体和长链脂肪酸CoA连接酶活性，下调的DWPs富集在肌动蛋白细胞骨架的调节、基因表达的正调控以及小GTP酶介导的信号转导通路（图1D、1H）。
从图2A可以观察到DSS对照组隐窝结构不规则，原因是隐窝炎和隐窝消失，与DSS对照组相比，DWPs和BWPs均能逆转DSS诱导的结肠黏膜隐窝深度的缩短，这种作用在给予DWPs的小鼠中更加明显（图2B）。
根据结肠长度、体质量、DAI评分和病理评分来评估结肠炎症状。与对照组相比，DSS治疗7天显著缩短了DSS组的结肠长度（P0.01），而DWP或BWP治疗显著改善了结肠长度（图2C）。与健康组（图2D-F）相比，DSS组表现出严重的体质量减轻、更高的DAI评分和病理学评分。与DSS组（P＜0.01）相比，DWP和BWP给药降低了DAI评分和病理学评分，增加了体质量。其中DWP组结肠长度（P＜0.05）、体质量（P＜0.01）、DAI评分（P＜0.05）、病理评分（P＜0.05）均显著高于BWP组。总之，DWPs比BWPs更能有效地改善DSS诱导的结肠炎。
利用八色流式细胞术来分析DSS诱导的UC小鼠的免疫细胞组成，结果显示，CD45 + CD3 − CD19 + B细胞、CD45 + CD3 + T细胞和CD45 + CD3 + CD4 + T细胞的百分比显著降低（P＜0.05），而经DWP处理的结肠炎小鼠中CD45+CD3+CD8+T细胞水平与DSS处理的对照小鼠的水平相比没有变化（图3A、B，P＞0.05）。调节性T细胞IL2（CD25）和FOXP3受体的表达，对DSS诱导的UC免疫稳态的恢复至关重要。BWP组结肠组织中CD25的丰度（（23±1.22）%）高于DSS组（（20±6.5）%），DWP组的CD25丰度（（33±2.5）%）显著高于DSS组（P＜0.05；图3C、D）。
在炎症性肠病和实验性结肠炎中，CD206+M2-样巨噬细胞数量减少。本实验发现BWP和DWP组的CD206+M2-样巨噬细胞群主要积聚在肠系膜淋巴结中，而在DSS诱导的结肠炎小鼠中，CD206+M2-样巨噬细胞的数量显著减少（P＜0.05，图3C、D）。与其他组相比，DSS组的CD206+M2-样巨噬细胞数量最低。结果表明，DWPs改变了DSS诱导的结肠炎小鼠的免疫细胞组成，并通过最大限度的减少炎细胞浸润来抑制炎症。
在炎症反应中，S100A8/A9被主动释放，并通过刺激白细胞募集和诱导细胞因子分泌发挥关键调节作用。先前的研究表明，S100A8是一种Toll样受体（TLR）激动剂，在DSS诱导的CAC小鼠模型和人类结肠癌症标本中上调，此外，肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）对NF-κB至关重要，导致“TLR-TRAF6-NF-κB”信号通路的出现。在炎症反应中，包括NF-κB和JunB在内的转录因子作为TLR刺激后快速诱导的基因的启动子，并且NF-κB在巨噬细胞炎症中诱导MPO表达。在本研究中，BWP组的S100A8阳性率显著低于DSS组（P＜0.05），而DWP组的阳性率低于BWP组（P＜0.01；图4A、B）。DWP组TRAF6阳性率与DSS诱导的UC一致（图4A、C）。BWP组的JunB阳性率显著低于DSS组（P＜0.001），而DWP组的阳性率明显低于BWP组（P＞0.001），DWP组的NF-κB表达显著低于DSS组（P＜0.005），而BWP组的表达并不显著低于DSS小组（P＞0.05；图4A、E、G）。同样，DWP组MPO的表达显著低于DSS对照组（P＜0.005；图4A太阳成集团tyc45668cn、F）。
与实验性结肠炎组相比，DWP处理组的促炎细胞因子（TNF-α、IFN-γ和MCP-1）显著降低抗炎细胞因子（IL-10）显著增加（图5A-D），表明DWP具有抗炎作用。NF-κB是一种参与LPS介导的多种细胞因子和炎症产物的诱导的转录因子。本实验使用小鼠单核细胞RAW264.7或人THP-1细胞系进一步验证DWP的抗炎活性，在LPS刺激的RAW和THP-1细胞中，DWPs通过NF-κB强烈抑制LPS诱导的DNA结合（图5E）。其次，检验DWP是否抑制LPS诱导的健康个体PBMC中NF-κB蛋白的表达（图5F）。结果显示，DWP治疗显著降低了CD86（图5G）和NF-κB的表达（图5H）。由此表明，DWPs较BWPs更能有效地预防DSS诱导的结肠炎（图6）。
本实验研究DWP介导的NF-κB失活是否对DSS诱导的结肠炎具有保护作用。结果表明，与阳性对照组（BWPs）和阴性对照组（PBS）相比，DWPs抑制DSS诱导的结肠炎发展，能够调节肠道中淋巴细胞的组成，导致Tregs的积累并增加CD206+巨噬细胞的数量。从机制上证明DWPs可能通过抑制S100A8-TRAF6-NF-κB轴发挥保护作用。目前，BWPs是用于缓解结肠炎最常用的乳制品，BWPs可减少T细胞、NK细胞和树突状细胞的浸润，可能通过调节免疫反应来抑制结肠炎的发展。在本研究中观察到DWPs比BWPs更有效地改善DSS诱导的结肠炎。KEGG通路富集分析结果表明，DWP调节基因在抗炎信号通路中的富集程度高于BWP调节基因。因此，根据目前的研究结果和之前发表的研究结果，DWP作为一种功能性食品，可以通过调节免疫来改善DSS诱导的小鼠结肠炎。
缺乏Treg或Treg功能的小鼠更容易发生自发性结肠炎和T细胞诱导的结肠炎。在这项研究中发现，与正常小鼠相比，DSS处理的小鼠中CD4+和CD8+T细胞的比例显著增加，而Tregs的比例降低。尽管阳性对照有作用，特别是BWPs促进DSS诱导的结肠炎的免疫恢复，但DWP在调节免疫功能方面表现更好。在结肠中，DWPs促进Treg浸润并调节T细胞稳态，证明其可以抑制炎症反应。
研究发现，与阳性和阴性对照相比，在DSS诱导的结肠炎中，DWPs灌胃给药可显著降低S100A8、TRAF6和NF-κB的表达，表明DWPs可以抑制炎症反应。总之，该研究鉴定了一种新的功能性食品成分DWPs，它可以在体内缓解结肠炎的发展。同时证明DWPs可以通过抑制结肠炎症从而维持T细胞稳态。
乳清蛋白在胃和小肠中很容易被消化，进入结肠的乳清蛋白量很少，因此推测起抗结肠炎作用的物质可能是乳清蛋白的消化产物。本研究仅探讨了乳清蛋白对生物体摄食后结肠炎的抑制作用，未考虑乳清蛋白的消化作用。之后计划对驴乳清蛋白消化产物进行表征，并富集这些肽段进行功能验证。
本研究通过蛋白质组学技术、GO和KEGG分析评估了DWPs和BWPs的蛋白质图谱，揭示蛋白质调节炎症和免疫相关途径。利用体内实验进一步证明DWPs比BWPs更有效地抑制DSS的进展。此外，流式细胞术和免疫组织化学显示出DWPs通过调节T细胞稳态和减少炎症来减轻结肠炎。因此，我们的研究结果表明，DWPs可以显著抑制结肠炎的发展，有望成为一种缓解UC的新型功能性食物。
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家肉类加工工程技术研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，贵州大学、贵阳学院共同主办，贵州医科大学、清华大学深圳国际研究生院、河南省大鲵保护与发展协会、国家市场监管重点实验室（特殊食品监管技术）支持协办，中国食品杂志社《肉类研究》杂志、《乳业科学与技术》杂志、《Food Science of Animal Products》承办，钛和中谱检测技术（厦门）有限公司、贵州油研纯香生态粮油科技有限公司、岛津企业管理(中国)有限公司、四川安好众泰科技有限公司、贵州成义烧坊酒业股份有限公司、贵州黔醉酒业（集团）有限公司、黔东南民生食品有限公司、贵州普安红茶业（集团）有限公司等企业赞助的“2023年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”即将于2023年10月28-29日在贵州贵阳召开。
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